激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)應(yīng)用

　　激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化。已廣泛應(yīng)用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經(jīng)生物學等領(lǐng)域，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強有力的研究工具。

　　創(chuàng)建于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項具有劃時代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國“政府新產(chǎn)品獎”和兩次“高科技領(lǐng)先技術(shù)獎”，它能達到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實時，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器?，F(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細胞生物學中的應(yīng)用。

　　1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成

　　有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡，1985年WijnaendtsVanResandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學中應(yīng)用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。

　　激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，再通過焦點處的針孔，由檢測器接收。

只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠到達檢測器，其它位置發(fā)出的光均不能過針孔。由于物鏡和會聚透鏡的焦點在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過程中針孔起著關(guān)鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對比度和分辨率有重要的影響。

　　ACASULTIMa312采用快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點掃描成像，由于樣品中不同的掃描點始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個樣品，掃描精度達0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當激光逐點掃描樣品時，針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像，并將之轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚聚焦圖像。一個微動步進馬達控制栽物臺的升降，使焦平面依次位于標本的不同層面上，可以逐層獲得標本相應(yīng)的光學橫斷面的圖像。這稱為“光學切片”。再利用計算機的圖像處理及三維重建軟件?？梢缘玫礁咔逦葋肀憩F(xiàn)標本的外形剖面，十分靈活、直觀地進行形態(tài)學觀察。